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在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用EGFP作为荧光标记探针。碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

1. 微量试剂取用前请离心集液。
   
2. Annexin V-EGFP，Propidium Iodide(PI)避光保存及使用。
   
3. Propidium Iodide(PI)有毒，操作时请戴手套。
   
4. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1×10⁵，不推荐用于检测组织样本。
   
5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮刀会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
   
6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
   
7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

1. 细胞收集
   
   1. 悬浮细胞：800g离心力，离心5min收集。
      
   2. 贴壁细胞：贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集。
      注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性。
2. 用PBS洗涤细胞二次(800g离心力，离心5min)收集1～5×10⁵细胞；
   
3. 加入500μL的Binding Buffer轻轻吹匀成单细胞悬液；
   
4. 加入5μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀；
   
5. 室温、避光、反应10～20min；
   
6. 请在1小时内，进行流式细胞仪的观察和检测。
   
7. 流式细胞仪分析
   
   1. 用流式细胞仪检测，Annexin V-EGFP(Ex=488nm,Em=530nm)的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光(Ex=488nm,Em≥630nm)通过PI通道(FL2或FL3)检测，建议使用FL3。
      
   2. 荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。